01游离DNA检测技术发展之路
早在年，Mandel和Metais就发现了在人体血液中存在着游离形式的DNA。年至年间，科学家们发现血液游离DNA与原发肿瘤基因突变具有一致性。然而在中国专利文摘数据库（CNABS）和德温特世界专利索引数据库（DWPI）中采用关键词和分类号进行检索（截止日期至年4月2日）发现，有关游离DNA在肿瘤中应用的第一个专利申请出现在年，持续到年申请量依旧不高。这是因为游离DNA在血液等体液中含量非常低，当时的DNA提取手段和检测方法都难以达到高特异性和高灵敏度的标准。此后，随着检测技术的发展，如第三代、第四代测序技术、数字PCR等技术的不断成熟，使得在血液中含量很低的游离DNA无处遁形，并且其含量变化、基因突变和甲基化的各个方面都能被检测到。因此年之后，游离DNA在肿瘤检测中应用的相关专利申请进入快速增长期，与年的15件申请量相比，年的全球申请量达到了80件。游离DNA在肿瘤检测中的应用主要体现在早期诊断和筛查、靶向用药、动态监测和预后判断四个方面。如在靶向用药指导方面，北京泛生子基因科技有限公司在针对EGFR突变位点上的检测申请了三个相关专利，并在后续推出了基因检测服务，为个体化治疗提供了重要的信息。在早期诊断和筛查方面，UCLBusiness公司专利公开号为WOA的专利检测游离DNA可变位置的甲基化状态，实现了膀胱癌的早期诊断以及个体化用药指导。02
笔者分析专利申请人类型发现，国内外公司是专利申请的主力，其中排名靠前的有被认为是全球液态活检标杆企业的夸登特公司（GuardantHealth），以及全球最大测序公司伊鲁米那（Illumina）旗下的格瑞尔公司（Grail）。夸登特公司是世界领先的综合性液体活检公司之一，也是第一家将全面的基因组活检商业化的公司。该公司于年推出了其第一个商用血液癌症筛检产品Guardant，该产品仅需两小瓶血液就可以做到无创的癌症检测，主要针对晚期实体瘤的基因检测，能够帮助患有晚期癌症的患者进行靶向治疗，帮助医生选择最佳的治疗方案。夸登特公司又进一步推出了Guardant+，并与多个大型制药公司合作，用于临床检测和筛选潜在的肿瘤相关突变基因。通过对该公司所申请的专利进行分析发现，与大多数专利申请仅保护运用现有检测技术检测具体肿瘤的应用不同，夸登特公司所有的15件专利申请，均是对检测方法以及富集方法的改进进行保护，这足以看出夸登特公司在该领域中的领先地位及雄厚的研发实力。如专利公开号为WO106768A的专利，对肿瘤细胞中DNA拷贝数变异的检测技术进行了改进。其首先对游离DNA进行测序，获得测序读段，生成第一数据集，包括遗传基因座的鸟嘌呤-胞嘧啶含量（GC含量）相关的定量，通过进行饱和平衡校正和探针效率校正来校正第一数据集，确定第一数据集的基线读段覆盖，其中基线读段覆盖涉及饱和平衡和探针效率，最后确定多个遗传基因座中每个遗传基因座相对于基线读段覆盖的拷贝数状态。通过对数据校正方面进行改进，提高了检测的准确性。又如专利公开号为WOA的专利，公开了富集多个基因组区域的方法，分别设定两组捕获探针，分别选择性地与第一基因组区域和第二基因组区域杂交，测量第二捕获探针组的捕获效率，作为诱饵浓度的函数，识别滴定曲线内的拐点，从而识别与探针相关的饱和点。选择第一捕获探针组的饱和点，使得观察到的捕获效率在所述捕获探针浓度的两倍于所述第一浓度的两倍时增加小于10％，最后对富集的核酸进行测序产生多个测序读数，通过生物信息学的方法对数据进行分析。通过对目标检测区域的富集，减少了测序成本。香港中文大学在该领域的研发实力也不容小觑，其在该领域的11件专利申请全部由卢煜明教授团队提交。卢煜明所在团队在年发现母体血液中存在胎儿游离DNA，并在随后开展了一系列工作重点研究这些胎儿游离DNA的特性，证明了使用胎儿游离DNA来诊断遗传疾病的可行性和实用性，最终开创了利用二代基因测序来检测唐氏综合症的新途径，并在90多个国家得到了应用，被誉为“无创DNA产前检测”的奠基人。随着游离DNA与肿瘤关系研究热度的提升，卢煜明团队迅速将游离DNA的研究方向拓展到了肿瘤检测的应用领域。其中最主要的是将游离DNA的检测应用到肝癌和鼻咽癌的早期诊断中。专利申请号为CN8的专利是卢煜明团队最早的一篇有关游离DNA应用于肿瘤检测中的专利申请，通过实时定量PCR检测游离DNA中是否存在EBV病毒的相关核酸序列或其水平的变化情况，从而判断是否患有EBV相关癌症或其进展。此后，卢煜明教授团队致力于游离DNA在鼻咽癌检测中应用的研究，专利公开号为WO020057A公开了通过靶向测序的技术，能够对鼻咽癌患者进行早期的诊断和筛查。之前的研究发现在人体内发现有EBV病毒并不代表会发展成鼻咽癌，而该专利申请通过靶向测序甲基化水平，通过设定截止值和计算方法，对鼻咽癌进行早期的诊断和筛查，大大增加了鼻咽癌诊断的准确性和灵敏性。基于此研究，卢煜明团队与Grail公司合作，计划将该结果应用于商业化检测中。深圳海普洛斯公司是国内的一家于年成立的定位与精准医疗和基因大数据的生物科技公司，其基于高通量测序和ddPCR技术研发的基因检测产品，能够为患者提供实时、准确的用药指导、疗效监测、预后判断等信息。专利申请号为CN1的专利，对肺癌相关的个基因进行检测，从而对肺癌患者提供个体化精准用药指导，并通过后续的深入研究和临床试验，推出了HapOncoTM肺癌临床用药基因检测产品。在笔者看来，国内公司大多数还集中在提供相应的检测服务，属于技术含量相对较低的环节，而上游的仪器制备、下游的数据分析解读环节，则大多都被国外公司垄断。这说明我国在该领域处在发展初期阶段，在对技术要求更高的上游以及需要一定样本积累的下游还不具备与国外大公司竞争的实力。但是笔者相信，随着研发实力的增强以及医疗领域相关政策的扶持，中国在该领域必然能够占据一席之地。本期作者医药生物发明审查部生物室季璇馨（本文已刊载于中国知识产权报，部分图片来源于网络）审校：解静美编：彭楠王乃兵CONTACTUS国家知识产权局专利局专利审查协作江苏中心苏州慧谷知识产权服务有限公司